Pemisahan Protein

Pada laboratorium yang lengkap, pemisahan protein dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu :

1. Salting out. Tiap-tiap protein berbeda sifat pengendapannya.
2. Ultra sentrifugasi. Protein dengan BM yang besar akan mengendap paling cepat.
3. Elektroforesis. Perbedaan kecepatan migrasi pada medan listrik berdasarkan IEP.
4. Kromatografi. Perbedaan kecepatan gerak pada media berdasarkan ukuran molekul.
5. Teknik immunokimia. Antibodi tertentu akan terikat dengan antigen yang sesuai.

Pembuatan filtrate bebas protein menurut :
1. Folin Wu
Masukkan 1 mL serum kdalam tabung sentrifuge. Tambahkan 7 mL aquadest, kemudian campur larutan. Tambahkan 1 mL  Na. Tungstat 10%, campur lalu tambahkan 1 mL H2SO4 2/3 N. Campur sampai rata selama 3 menit dan diamkan selama 5 menit. Setelah itu sentrifuge selama 5 menit dan ambil filtratnya, atau dapat pula disaring dengan kertas saring. Mengambil filtrate harus hati-hati, jangan sampai endapan ikut masuk ke pipet. Cara yang lebih aman untuk mengambil filtrate adalah dengan disaring.
2. Somogy
Masukkan 1 mL darah/serum/plasma ke dalam tabung sentrifuge. Tambahkan 7 mL aquadest, campur dengan baik agar darah haemolisis (jika yang digunakan adalah darah). Tambahkan 1 mL ZnSO4 10%, campur dengan baik dan tambahkan 1 mL NaOH 0,5N. Setelah itu, sentrifuge selama 5 menit dan ambil filtratnya. Ambil filtratnya dengan hati-hati jangan sampai keruh, atau dapat pula disaring dengan kertas saring.
Pustaka :
Dr. Zulbadar Panil, 2008, Memahami Teori dan Praktik Biokimia Dasar Medis. ( EGC-Jakarta)


Metode kromatografi dapat diterapkan dengan menggunakan bangku-top peralatan HPLC kolom atau otomatis. Separation by HPLC can be done by reverse-phase, ion-exchange or size-exclusion methods, and samples detected by diode array or laser technology. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase-balik, pertukaran ion atau ukuran-pengecualian metode, dan sampel terdeteksi oleh array dioda atau teknologi laser.

• Reverse-phase chromatography (RPC) separates proteins based on their relative hydrophobicities . Kromatografi fase-balik (RPC) memisahkan protein berdasarkan hydrophobicities relatif mereka. This technique is highly selective but requires the use of organic solvents. Teknik ini sangat selektif tetapi membutuhkan penggunaan pelarut organik. Some proteins are permanently denatured by solvents and will lose functionality during RPC, therefore this method is not recommended for all applications, particularly if it is necessary for the target protein to retain activity. Beberapa protein didenaturasi dengan pelarut secara permanen dan akan kehilangan fungsi selama RPC, karena metode ini tidak direkomendasikan untuk semua aplikasi, terutama jika diperlukan untuk protein target untuk mempertahankan aktivitas.
• · Ion-exchange chromatography refers to separation of proteins based on charge . · Pertukaran ion kromatografi mengacu pada pemisahan protein berdasarkan biaya. Columns can either be prepared for anion exchange or cation exchange. Anion exchange columns contain a stationary phase with a positive charge that attracts negatively charged proteins. Cation exchange columns are the reverse, negatively charged beads which attract positively charged proteins. Kolom baik dapat disiapkan untuk pertukaran anion atau kation anion exchange rates kolom berisi fase diam dengan muatan positif yang menarik protein bermuatan negatif kation kolom pertukaran sebaliknya.,. Manik-manik bermuatan negatif yang menarik protein bermuatan positif. Elution of the target protein(s) is done by changing the pH in the column, which results in a change or neutralization of the charged functional groups of each protein. Elusi dari protein target (s) dilakukan dengan mengubah pH dalam kolom, yang menghasilkan perubahan atau netralisasi kelompok fungsional protein bermuatan masing-masing.

• Size-exclusion chromatography ( gel filtration ) separates larger proteins from small ones, since the larger molecules travel faster through the cross-linked polymer in the chromatography column. Ukuran-pengecualian kromatografi (filtrasi gel) memisahkan protein yang lebih besar dari yang kecil, karena molekul yang lebih besar perjalanan lebih cepat melalui polimer cross-linked dalam kolom kromatografi. The large proteins do not fit into the pores of the polymer whereas smaller proteins do, and take longer to travel through the chromatography column, via their less direct route. Protein besar tidak masuk ke pori-pori polimer sedangkan protein yang lebih kecil, dan lebih lama untuk melakukan perjalanan melalui kolom kromatografi, melalui rute kurang langsung mereka. Eluate is collected in a series of tubes separating proteins based on elution time. Eluat dikumpulkan dalam serangkaian tabung memisahkan protein berdasarkan waktu elusi. Gel filtration is a useful tool for concentrating a protein sample, since the target protein is collect in a smaller elution volume than was initially added to the column. Filtrasi gel adalah alat yang berguna untuk berkonsentrasi sampel protein, karena protein target adalah mengumpulkan dalam volume elusi lebih kecil dari pada awalnya ditambahkan ke kolom. Similar filtration techniques might be used during large scale protein production because of their cost-effectiveness. Teknik filtrasi yang sama dapat digunakan selama protein skala produksi besar karena efektivitas biaya mereka.

• Affinity chromatography is a very useful technique for "polishing" or completing the protein purification process. Afinitas kromatografi adalah teknik yang sangat berguna untuk "memoles" atau menyelesaikan proses pemurnian protein. Beads in the chromatography column are cross-linked to ligands that bind specifically to the target protein. Manik-manik dalam kolom kromatografi adalah cross-linked untuk ligan yang mengikat khusus untuk protein target. The protein is then removed from the column by rinsing with a solution containing free ligands. Protein ini kemudian dihapus dari kolom dengan berkumur dengan larutan yang mengandung ligan bebas. This method generally gives the purest results and highest specific activity compared to other techniques. Metode ini umumnya memberikan hasil paling murni dan tertinggi aktivitas spesifik dibandingkan dengan teknik lain.

Protein Visualization and Assessment of Purification Visualisasi Protein dan Penilaian Pemurnian
· SDS-PAGE is polyacrylamide gel electrophoresis, performed in the presence of SDS (sodium dodecyl sulfate) which binds to proteins giving them a large net negative charge. · SDS-PAGE elektroforesis gel poliakrilamida adalah, dilakukan di hadapan SDS (natrium dodesil sulfat) yang mengikat ke protein memberikan mereka muatan negatif yang besar bersih. Since the charges of all proteins are fairly equal, this method separates them almost entirely based on size. Karena biaya dari semua protein yang cukup sama, metode ini memisahkan mereka hampir seluruhnya didasarkan pada ukuran. SDS-PAGE is often used to test the purity of a protein after each step in a series. SDS-PAGE sering digunakan untuk menguji kemurnian protein setelah setiap langkah dalam seri. As unwanted proteins are gradually removed from the mixture, the number of bands visualized on the SDS-PAGE gel, is reduced, until there is only one band representing the desired protein. Sebagai protein yang tidak diinginkan secara bertahap dihapus dari campuran, jumlah band divisualisasikan pada gel SDS-PAGE, berkurang, sampai hanya ada satu band yang mewakili protein yang diinginkan.

Teks asli Inggris

Size-exclusion chromatography ( gel filtration ) separates larger proteins from small ones, since the larger molecules travel faster through the cross-linked polymer in the chromatography column.

Sarankan terjemahan yang lebih baik